轮盘游戏秘籍_《自然》子刊:颠覆认知!科学家揭示CRISPR/Cas9切口全新连接机制,未来有望实现精准连接|科学

2020-01-11 12:50:43

轮盘游戏秘籍_《自然》子刊:颠覆认知!科学家揭示CRISPR/Cas9切口全新连接机制,未来有望实现精准连接|科学

轮盘游戏秘籍,“再一次一无所知,从头开始……这让我很开心。”——斯托帕德《阿卡狄亚》

从2013年张锋[1]和george church[2]第一次使用crispr-cas9编辑人体细胞算起,这项技术在人体细胞中的使用已经走过5个年头。

虽然crispr被科学家使用的很溜,并已经走到临床试验阶段;但我们对cas9的切割原理和切割后细胞修复机制的了解还比较少,甚至可以说它们还是个黑盒子。

前不久,上海交通大学吴强教授课题组在molecular cell上发表了一篇文章,他们发现cas9切割dna双链可以产生突出末端,而不仅仅是平头末端,这颠覆了我们对cas9切割的认知[3]。

近日,加州大学伯克利分校的jacob corn团队在cas9切割后的修复机制上也取得了颠覆认知的重大突破。

通讯作者jacob corn(后排右四),第一作者chris richardson(后排右五)

总的来说,corn团队这次解决了一个长期困扰科学家的问题:用crispr-cas9切断细胞的dna之后,细胞究竟是如何选择用哪种方式修补断裂的缺口的?

更重要的是,他们的这个发现甚至可以让科学家以后根据自己的需求,操纵细胞的修复方式,让细胞基因组dna在被cas9切断后,按照需求去修复缺口。正真实现精准切割,精准修补。

这对很多需要做基因修复的遗传疾病而言,无疑是个好消息。上周四,corn团队的这一重要研究成果发表在《自然遗传学》上[4]。

crispr-cas9只是上帝的手术刀,修复还是得靠细胞

一直以来,我们都形象地把crispr-cas9叫做“上帝的手术刀”,而不把它叫做“上帝的针线包”,主要是因为cas9只负责精准的切断dna,修复的任务要交给细胞自身。

通常情况下,crispr-cas9切断dna形成的双链断裂后,细胞会很快启动紧急修复机制。其中最主要的两条是:非同源末端连接和同源重组。

其中非同源末端连接修复机制被科学家用的最多,效率也最高。它就是不管三七二十一,尽快把断裂的dna连接起来,维持dna的稳定。这种修复方式绝大部分情况下会在切割位点产生随机插入或缺失,直接导致基因功能丧失。

无论如何,对细胞而言,损失一个基因,比挂了肯定好多了。这种修复方式其实也是细胞的最常见修复方式。鉴于这种修复方式的特点,它被广泛用于基因功能的研究。

而同源重组修复机制,则是在有同源供体dna序列的配合下,用一段正确的基因序列替换原本错误的基因序列[5]。也就是我们常说的:哪里坏了,换哪里。科学家和医生治疗基因变异导致的疾病,依赖的就是这种修复方式[6]。

目前,同源重组修复过程中使用的外源dna模版有两种:一种是双链dna,另一种是单链dna模版修复(sstr)。

crispr/cas9切断dna之后的可能修复机制

不过,大量的研究表明,把双链dna作为模版修复断裂的dna在绝大多数细胞类型中是非常低效的[7]。相较而言呢,以单链dna为修复模版的sstr模式在人类细胞中倒是很高效[8],所以使用的也比较多。

虽然sstr效率高,但是corn团队在不同的人类癌细胞系中做研究还是发现,sstr的修复效率还是有很大的差异,从完全无效的0%,到非常高效的30%。这似乎暗示,sstr是否能完成修复与细胞类型有一定的关联。

再仔细一想呢,不同细胞类型的基因表达水平实际上是相差很大的,是不是某些特殊的dna修复通路的打开或关闭,影响了sstr修复的效率呢?

不同模版的修复过程

如果我们能发现影响sstr修复机制的相关基因,那么在以后的临床应用中,在编辑基因的同时,特异性的调节相关基因的表达水平。那转化效率就可以大幅提升,治疗效果也会稳步提升啊。

研究人员赶紧去查查相关资料。

很幸运,sstr在人体中修复的机制还鲜为人知。如果能解决这个困扰着很多科学家的问题,那么corn团队肯定很开心。

此处应该再次出现斯托帕德那句话:“再一次一无所知,从头开始……这让我很开心。”

聪明的实验设计

corn团队的研究人员究竟有多开心我是没办法知道了。不过,当我看到他们解决问题的思路时,我何止是很开心,简直是很兴奋,以至于喝了5杯浓茶也没驱散的午间睡意,瞬间消散。

他们首先做了一个假设:既然是dna断裂的修复出现了不稳定的问题,那问题应该就处在细胞内跟dna修复有关的基因上;如果在调控那些修复基因表达的同时,同步开展crispr-cas9的剪切,和切断后的sstr修复,不就可以通过二者之间的相互作用找到影响sstr的关键基因了吗!

于是,研究人员首先找到了2000多个跟dna修复有关的基因。然后做了一个非常聪敏的设计。

他们创造性的使用了crispri基因沉默技术[9]、crispr-cas9基因编辑技术和荧光标记技术,创建了一个可视化的“沉默-编辑”平台。

首先,他们给所有的细胞加了个蓝色荧光基因,让这些细胞发蓝光。

所有的细胞都蓝莹莹的,真好看~

然后,给这些细胞分别装入用来沉默修复相关基因的crispri基因沉默系统。每个细胞沉默掉一个修复相关基因,在一个有数百万个细胞的群体中,就产生了2000个基因分别被沉默掉的细胞库。

建库过程

紧接着,研究人员就要对那个蓝色荧光蛋白基因下手了。

他们把靶向切割蓝色荧光蛋白基因的crispr-cas9编辑系统,以及一个与蓝色荧光蛋白基因有同源臂的绿色荧光蛋白基因的单链dna,一起转到上面的那个细胞库里。

接下里会发生什么,你们肯定能想到把,还需要我说吗~

忍不住了,我还是说下吧。

理想状况下(我们只说理想状况下),上面的细胞库颜色会发生如下变化。有些还是蓝色,意味着基因编辑失败;有一些细胞没有颜色了,大概率意味着意味着cas9把蓝色荧光蛋白基因切断了,然后细胞按照非同源末端连接的方式又把它随便连上了,导致基因功能丧失了;剩下的细胞成功变绿了,这些细胞实现了sstr修复。

研究人员用流式细胞仪按照颜色,给所有的细胞分分成三拨:有6.8%的细胞还保持这蓝色,有67.5%的细胞不显色了,22.8%的细胞变成了绿色。

加起来是97.1%,还有2.9%的细胞怎么了?这些细胞出现了理想状况之外的情况,我们就不管它们了。

编辑后的细胞颜色分布

未被重视的“交通信号灯”

有了上面的细胞。接下来的事情就好办了,用二代测序技术,分析分析这三个细胞群体中grna的水平变化,就可以知道哪些基因会影响sstr的效率了。

这一分析不要紧,研究人员发现之前认为与sstr修复有关的dna修复基因,似乎与sstr关系并不大。

让研究人员意外的是,那些处在范科尼贫血(fanconi anemia;fa)的通路上的基因,与sstr关系密切。

范科尼贫血是瑞士儿科医生guido fanconi在1927年首次报道的,它是一种罕见的常染色体隐性遗传性血液系统疾病[10]。1992年报道了4个可能与fa相关的基因,到现在已经鉴定出了20多个与fa的发病有关的基因变异。

fa通路涉及超多蛋白

一直以来,研究人员认为,fa通路上的基因编码的蛋白与识别和修复基因组中的链间交联(icl)有关。并不认为它与crispr-cas9导致的dna双链断裂修复有关。

这个发现,被研究人员视为至宝。

为了进一步证实fadna修复通路上的蛋白与sstr修复模式效率之间的关系。研究人员用crispri分别稳定地敲低了fa路径中的fanca,fancd2,fance,fancf,fancl,helq,ube2t,usp1和wdr48。发现sstr修复模式效率显著下降。

如果在敲低的同时,用cdna在细胞内稳定地表达那个敲低的蛋白,让它们的表达恢复到野生的水平。研究人员发现,sstr修复模式效率提升8倍,回升到正常水平。

这些研究表明,fa通路中的许多基因对sstr修复模式是必需的。

更有意思的是,研究人员还发现fa通路只影响sstr,它不会促进非同源末端连接。总体来说,在dna被切断之后,细胞修复dna的首选方式是非同源末端连接,这也是为什么这种修复方式一直比例最高。

fa通路就是个

而fa通路更像个“交通信号灯”:在fa通路不活跃的时候,所有的车都朝一个方向(非同源末端连接)开;但如果fa通路很活跃,那么它就要指挥其中一部分车往另一个方向(sstr)走。

原来是这样!

用论文第一作者chris richardson的话说,就是“fa通路是维持非同源末端连接和sstr之间平衡的”。

后记

“治疗镰状细胞贫血,成功的机会与用正确的基因替代突变的基因效率密不可分,”richardson这么评价自己的研究[11],“如果你从患者那里获得了100万个细胞,30%-40%的替换率肯定比10%的好多了。”

现在看来,richardson的愿望真的有可能实现了。

将来,科学家可以通过分析细胞基因的表达水平,提前预知一类细胞是否适合sstr。如果这类细胞sstr效率低,甚至可以考虑临时激活fa通路。

无论如何,科学家掌握了cas9切割后的这层修复机制,未来给患者换个基因啥的,那简直是效率高多了。

编辑神叨叨

crispr在临床中的应用,尽在medical trend。

参考资料:

[1]. cong l, ran f a, cox d m, et al. multiplex genome engineering using crispr/cas systems[j]. science, 2013, 339(6121): 819-823.

[2]. mali p, yang l, esvelt k m, et al. rna-guided human genome engineering via cas9[j]. science, 2013, 339(6121): 823-826.

[3]. shou j, li j, liu y, et al. precise and predictable crispr chromosomal rearrangements reveal principles of cas9-mediated nucleotide insertion[j]. molecular cell, 2018.

[4]. richardson c d, kazane k r, feng s j, et al. crispr–cas9 genome editing in human cells occurs via the fanconi anemia pathway[j]. nature genetics, 2018: 1.

[5]. sternberg s h, doudna j a. expanding the biologist's toolkit with crispr-cas9.[j]. molecular cell, 2015, 58(4): 568-574.

[6]. cox d b, platt r j, zhang f, et al. therapeutic genome editing: prospects and challenges[j]. nature medicine, 2015, 21(2): 121-131.

[7]. chen f, pruettmiller s m, huang y, et al. high-frequency genome editing using ssdna oligonucleotides with zinc-finger nucleases[j]. nature methods, 2011, 8(9): 753-755.

[8]. richardson c d, ray g j, dewitt m a, et al. enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive crispr-cas9 using asymmetric donor dna[j]. nature biotechnology, 2016, 34(3): 339-344.

[9]. gilbert l a, larson m h, morsut l, et al. crispr-mediated modular rna-guided regulation of transcription in eukaryotes.[j]. cell, 2013, 154(2): 442-451.

[10]. walden h, deans a j. the fanconi anemia dna repair pathway: structural and functional insights into a complex disorder[j]. annual review of biophysics, 2014, 43(1): 257-278.

[11]. http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/

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本文作者 | biotalker

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